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紫外交联仪的使用方法说明

发布时间: 2022-10-24  点击次数: 231次
   紫外交联仪的主要用途为在膜上交联核酸,其是一种254mm紫外辐射系统,其有很多用途,UV灭菌消除PCR污染、嘧啶二聚体产生的部分限制性内切酶消化、RecA突变筛选以及琼脂糖凝胶中DNA的切割等亦是其用途。其的应用价值也体现在聚合物紫外处理和紫外灭菌等方面。以下为紫外交联实验原理和步骤。
  紫外交联仪的使用步骤:
  1、混合10μL含有高亲和性蛋白结合位点的目的序列的单链M13载体和等摩尔的17 bp M13通用引物,使用1×限制性内切核酸酶缓冲液调节终体积到100μL。在90摄氏度下加热5分钟。在室温下冷却、
  2、在杂交混合物中加入Klenow酶5μL、水7μL、10×限制性内切核酸酶缓冲液7.5μL、0.1 mol/L二硫苏糖醇1.75μL、50×dNTP/BrdU溶液3.5μL、[α32P]dCTP50μ等反应物,在16摄氏度下温浴90分钟。
  3、在68摄氏度下加热10分钟,将Klenow酶灭活。
  4、使用40U限制性内切核酸酶在合适条件下消化,使得20600 bp的DNA片段产生。
  5、将乙酸铵添加到0.3 mol/L,DNA使用2倍体积的1**%乙醇进行沉淀,在TE缓冲液中重悬。
  6、电泳在含有0.5μg/mL溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行。所要的DNA片段使用DEAE膜进行分离。
  7、BrdU取代的DNA片段的特异活性使用闪烁计数器进行检测,DNA的浓度的估计采用溴化乙锭点迹定量法。能够采用迁移率变动DNA结合分析法来检测探针的完整性和功能。
  8、将下列结合反应建立于1.5 mL圆底小瓶中:将10-20μg DNA载体、经缓冲的含有结合蛋白的提取液以及105cpm均衡标记的探针混合,调节总体积到50μL。瓶口使用塑料薄膜封住,固定再采用Parafilm膜加封。
  9、在试管架上放上小瓶,于正上方5厘米处使用倒置的紫外透射灯照射1个小时。
  10、将1U微球菌核酸酶、DNA酶I 4μg、0.5 mol/L CaCl2 1μL等反应物加入到各结合反应管中,在37摄氏度下消化半个小时。
  11、在反应混合物中加入等体积的2×SDS样品缓冲液,在100摄氏度中煮沸5分钟。
  12、样品的电泳在适当浓度的不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行。
  13、完成电泳之后,将凝胶前沿的染料切去。
  14、干胶,使用增感屏放射自显影13日,来对交联的蛋白质进行观测。
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